Jak liczyć wyniki analizy chemicznej?

Szybka ścieżka: próbka, sygnał, stężenie i ocena jakości

Najprostszy schemat analizy ilościowej wygląda tak: najpierw przygotowujesz próbkę do pomiaru, potem mierzysz sygnał, następnie przeliczasz sygnał na stężenie, a na końcu oceniasz, czy wynik można traktować jako wiarygodny. W praktyce na każdym etapie może pojawić się inny wzór. Przygotowanie próbki wymaga współczynnika rozcieńczenia DF. Pomiar może wymagać odjęcia blanku. Kalibracja wymaga równania prostej y = a · x + b. Ocena czułości metody wymaga LOD i LOQ. Kontrola poprawności wymaga odzysku procentowego. Ocena powtarzalności wymaga RSD lub CV. Raportowanie wyniku wymaga niepewności.

Uczniowie często próbują rozwiązać całe zadanie jednym wzorem. To działa tylko w prostych przykładach. W zadaniu laboratoryjnym polecenie może brzmieć: „Próbkę rozcieńczono 25 razy, zmierzono sygnał 0,312, blank wynosił 0,018, krzywa kalibracyjna ma równanie y = 0,145x + 0,006, a LOQ wynosi 0,20 mg/l. Oblicz stężenie w próbce pierwotnej i oceń wynik”. Tu trzeba najpierw policzyć sygnał netto albo zastosować równanie kalibracyjne z odpowiednim blankiem, potem przeliczyć stężenie, pomnożyć przez DF i dopiero porównać z LOQ. Dlatego w tym poradniku każda część odpowiada innemu pytaniu z zadania, a nie tylko innemu wzorowi.

Blank i próba ślepa - kiedy odejmować tło?

Blank, czyli próba ślepa, pokazuje sygnał pochodzący z odczynników, rozpuszczalnika, kuwety, aparatu albo sposobu przygotowania próbki. W szkolnych zadaniach bywa zapisany jako „sygnał próby ślepej”, „absorbancja blanku”, „tło” albo „wynik odczynnika bez analitu”. Jeżeli blank jest istotny, sygnał netto próbki liczy się jako sygnał próbki minus sygnał blanku. Ten krok jest szczególnie ważny w metodach czułych, przy małych stężeniach oraz przy porównywaniu wyniku z LOD i LOQ. Nie chodzi tylko o kosmetyczną poprawkę, ale o odróżnienie sygnału analitu od sygnału, który pojawia się nawet wtedy, gdy analitu nie ma.

Kolejność odejmowania blanku zależy od tego, jak zbudowano kalibrację. Jeżeli wzorce i próbki mierzono względem tego samego blanku, a równanie kalibracyjne ma wyraz wolny wynikający z tej procedury, dodatkowe odejmowanie może być niepoprawne. Jeżeli natomiast zadanie osobno podaje sygnał próbki i sygnał blanku, zwykle należy policzyć sygnał netto, a dopiero potem przeliczyć go na stężenie. Dla ucznia praktyczna zasada brzmi: przeczytaj, czy krzywa kalibracyjna została już skorygowana o blank. Jeżeli nie, blank trzeba uwzględnić. Jeżeli polecenie mówi „po korekcie blanku”, nie odejmuj go drugi raz.

LOD i LOQ - jak interpretować wynik względem progu metody?

LOD to granica wykrywalności, a LOQ to granica oznaczalności. Wynik poniżej LOD zwykle traktuje się jako niewykryty w warunkach danej metody. Wynik pomiędzy LOD i LOQ może świadczyć o obecności analitu, ale nie jest dobrym wynikiem ilościowym. Wynik powyżej LOQ można zwykle raportować liczbowo, o ile spełnia pozostałe warunki: mieści się w zakresie kalibracji, próbka była przygotowana poprawnie, odzysk jest akceptowalny, a precyzja nie budzi zastrzeżeń. W zadaniach uczniowskich LOD i LOQ najczęściej liczy się ze wzorów LOD = 3s/a oraz LOQ = 10s/a, gdzie s jest odchyleniem standardowym blanku lub niskiego poziomu, a a jest nachyleniem krzywej kalibracyjnej.

Największa pułapka polega na porównaniu nie tej wielkości, co trzeba. Jeżeli LOD i LOQ są podane dla roztworu pomiarowego, a wynik końcowy przeliczono na próbkę pierwotną, porównanie musi być spójne. Albo porównujesz wszystko po rozcieńczeniu, albo wszystko po przeliczeniu na próbkę pierwotną. Nie wolno porównywać wyniku po DF z progiem przed DF, bo wtedy interpretacja jest przypadkowa. Do szybkiego rachunku i interpretacji użyj kalkulatora LOD i LOQ. W sprawozdaniu warto dopisać nie tylko liczbę, ale też zdanie: wynik jest poniżej LOD, między LOD i LOQ albo powyżej LOQ.

Odzysk procentowy - czy metoda naprawdę mierzy analit?

Odzysk procentowy odpowiada na pytanie, czy metoda potrafi odzyskać znaną ilość analitu z próbki. W praktyce robi się to na kilka sposobów: przez próbkę wzbogaconą, materiał odniesienia CRM albo wzorzec kontrolny. W zadaniu szkolnym może pojawić się informacja, że do próbki dodano znaną ilość substancji, a po analizie oznaczono określone stężenie. Odzysk liczy się jako stosunek ilości znalezionej do ilości oczekiwanej, pomnożony przez 100%. Jeżeli odzysk wynosi 100%, metoda idealnie odtworzyła wartość odniesienia. Jeżeli wynosi 85%, część analitu została utracona albo metoda zaniża wynik. Jeżeli wynosi 115%, może występować zawyżenie, efekt matrycy albo błąd przygotowania.

Odzysk jest szczególnie przydatny wtedy, gdy matryca próbki może przeszkadzać w oznaczaniu. Inaczej może zachowywać się czysty wzorzec w wodzie, a inaczej próbka ścieków, żywności, gleby, kosmetyku albo tabletki. Dlatego w interpretacji nie wystarczy napisać samego procentu. Warto dopisać, czy odzysk wskazuje na stratę analitu, zawyżenie wyniku lub możliwy wpływ składników próbki.

Zakres akceptacji odzysku zależy od metody, poziomu stężeń i wymagań ćwiczenia. W zadaniach edukacyjnych często spotkasz przykładowe przedziały 80-120%, 90-110% albo 95-105%. Nie traktuj ich jako jednej uniwersalnej normy dla wszystkich analiz. Dla ucznia najważniejsze jest, żeby porównać policzony odzysk z zakresem podanym w treści zadania i napisać wniosek. Jeżeli odzysk jest poza zakresem, wynik może wymagać powtórzenia, korekty metody albo komentarza w sprawozdaniu. Obliczenia przeprowadzisz w kalkulatorze odzysku procentowego metody analitycznej.

Niepewność pomiaru stężenia i zapis C ± U

Niepewność pomiaru opisuje przedział, w którym z określonym poziomem zaufania może znajdować się wynik. W zadaniach uczniowskich i studenckich najczęściej spotkasz niepewność standardową u(C), niepewność rozszerzoną U oraz współczynnik k, często równy 2. Jeżeli u(C) = 0,05 mg/l, a k = 2, to U = 0,10 mg/l. Wynik zapisuje się wtedy jako C ± U, na przykład 2,35 ± 0,10 mg/l. Taki zapis jest bardziej informacyjny niż sama liczba 2,35 mg/l, bo pokazuje, z jaką dokładnością można traktować rezultat.

Dla uczniów ważne jest też rozróżnienie między błędem a niepewnością. Błąd opisuje różnicę między wynikiem a wartością odniesienia, jeżeli taka wartość jest znana. Niepewność opisuje jakość samego wyniku i zakres możliwych wartości. Dlatego niepewności nie traktuje się jako „pomyłki”, lecz jako obowiązkowy element rzetelnego wyniku pomiarowego.

Do niepewności mogą wchodzić różne składowe: powtarzalność serii, niepewność kalibracji, pipetowania, objętości kolby, wzorca, rozcieńczenia, blanku albo odczytu aparatu. W prostych zadaniach zwykle podaje się gotowe składowe, które trzeba połączyć metodą pierwiastka z sumy kwadratów. Jeżeli składowe są niezależne, łączna niepewność standardowa rośnie wolniej niż zwykła suma. Ważne jest także zaokrąglanie. Niepewność powinna mieć sensowną liczbę cyfr znaczących, a wynik powinien być zaokrąglony do tego samego miejsca dziesiętnego. Do rachunku i zapisu końcowego użyj kalkulatora niepewności pomiaru stężenia.

Przykład krok po kroku: od sygnału do wyniku końcowego

Załóżmy, że próbkę wody rozcieńczono dziesięciokrotnie. Zmierzony sygnał próbki wynosi 0,485, sygnał blanku 0,025, a krzywa kalibracyjna ma równanie y = 0,230c + 0,000. Najpierw liczymy sygnał netto: 0,485 - 0,025 = 0,460. Potem przeliczamy sygnał na stężenie roztworu pomiarowego: c = 0,460 / 0,230 = 2,00 mg/l. Ponieważ próbkę rozcieńczono 10 razy, stężenie w próbce pierwotnej wynosi 20,0 mg/l. Jeżeli LOQ metody w przeliczeniu na roztwór pomiarowy wynosi 0,15 mg/l, wynik 2,00 mg/l jest powyżej LOQ, więc można go traktować jako wynik ilościowy w tym uproszczonym przykładzie.

Teraz dodajemy ocenę jakości. Jeżeli seria powtórzeń dała średnią 20,0 mg/l i odchylenie standardowe 0,6 mg/l, RSD wynosi 3,0%. Jeżeli wartość odniesienia dla próbki kontrolnej wynosi 19,5 mg/l, bias wynosi 0,5 mg/l, czyli około 2,6%. Jeżeli niepewność rozszerzona U wynosi 1,2 mg/l, wynik można zapisać jako 20,0 ± 1,2 mg/l. W dobrze napisanym rozwiązaniu uczeń nie kończy na jednym działaniu, tylko zapisuje krótką interpretację: wynik jest powyżej LOQ, seria ma RSD 3,0%, bias względem wartości odniesienia jest niewielki, a raportowany wynik to 20,0 ± 1,2 mg/l. Właśnie taki sposób pisania odpowiedzi dobrze sprawdza się w sprawozdaniach.

Najczęstsze błędy w zadaniach z analizy chemicznej

Najczęstszy błąd to brak rozdzielenia próbki pierwotnej i roztworu pomiarowego. Uczeń liczy stężenie z krzywej kalibracyjnej i zapomina, że dotyczy ono roztworu po rozcieńczeniu. Drugi błąd to pomijanie blanku albo odejmowanie go dwa razy. Trzeci błąd to porównanie wyniku po rozcieńczeniu z LOD lub LOQ zapisanym dla innego etapu. Czwarty błąd to traktowanie RSD jako błędu względem wartości odniesienia. RSD opisuje rozrzut serii, a bias opisuje przesunięcie względem wartości odniesienia. Piąty błąd to zapis wyniku z niepewnością bez jednostki albo z inną liczbą miejsc dziesiętnych niż U.

Warto też uważać na jednostki. Mg/l i µg/l różnią się tysiąckrotnie. Mol/l i mmol/l również. W twardości wody pojawia się dodatkowo mg CaCO3/l, stopnie niemieckie °dH i stopnie francuskie °fH, więc nie każdy wynik opisuje bezpośrednio masę wapnia. Przy miareczkowaniu EDTA sprawdź kompleksometrię EDTA i twardość wody. Przy miareczkowaniu kwas-zasada sięgnij po kalkulator miareczkowania kwas-zasada. Jeżeli zadanie dotyczy klasycznych stężeń i przygotowania roztworów, przyda się także rozcieńczanie roztworów.

• Nie mieszaj sygnału ze stężeniem. Sygnał wymaga kalibracji.
• Nie pomijaj DF. Wynik po rozcieńczeniu trzeba przeliczyć na próbkę pierwotną.
• Nie myl LOD z LOQ. Wykrycie nie zawsze oznacza oznaczenie ilościowe.
• Nie nazywaj RSD dokładnością. RSD dotyczy precyzji serii.
• Nie zapisuj C ± U bez jednostki. Jednostka jest częścią wyniku.

Jak opisać wynik w sprawozdaniu z chemii analitycznej?

Dobry opis wyniku nie powinien składać się tylko z liczby. W sprawozdaniu warto napisać, jak próbka była przygotowana, czy zastosowano blank, jak wyznaczono stężenie, czy wynik znajduje się w zakresie kalibracji, czy jest powyżej LOQ, jaki był odzysk, jaka była precyzja serii i jak zapisano niepewność. Nie trzeba tworzyć bardzo długiego akapitu, ale kilka zdań pokazuje, że rozumiesz proces analityczny. Przykład: „Stężenie analitu w próbce pierwotnej po uwzględnieniu rozcieńczenia DF = 10 wyniosło 20,0 mg/l. Wynik przekracza LOQ metody, dlatego został potraktowany jako wynik ilościowy. Seria powtórzeń dała RSD = 3,0%, a wynik zapisano jako 20,0 ± 1,2 mg/l”.

Dobry opis powinien być krótki, ale konkretny. Zamiast pisać „wynik jest dobry”, lepiej podać powód: wynik jest powyżej LOQ, mieści się w zakresie kalibracji, odzysk znajduje się w przedziale akceptacji, a RSD serii jest małe. Taki komentarz pokazuje, że nie tylko wykonano rachunek, ale również oceniono sens otrzymanej liczby.

Jeżeli w zadaniu pojawia się odzysk, dopisz, czy mieści się w zakresie akceptacji. Jeżeli pojawia się próbka kontrolna albo materiał odniesienia, dopisz bias lub błąd względny. Jeżeli wynik jest poniżej LOQ, nie udawaj pełnej dokładności liczbowej. Wtedy lepszy jest komentarz, że analit został wykryty, ale wynik nie powinien być raportowany jako w pełni ilościowy. Taki sposób pisania odpowiedzi przydaje się nie tylko na chemii analitycznej, lecz także w biologii, ochronie środowiska, farmacji, technologii żywności i wszędzie tam, gdzie wynik pomiaru musi mieć interpretację.