Chemia analityczna: LOD, LOQ, odzysk i niepewność - tablica

Mapa obliczeń: od próbki do wyniku analitycznego

Najwygodniej traktować chemię analityczną jak ciąg kolejnych decyzji. Nie zaczynaj od pytania „jaki wzór zastosować?”, tylko od pytania „co oznacza liczba, którą mam w zadaniu?”. Sygnał z aparatu nie zawsze jest jeszcze stężeniem próbki pierwotnej. Często trzeba odjąć blank, skorzystać z krzywej kalibracyjnej, pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia, a dopiero potem ocenić wynik względem LOD, LOQ, odzysku, RSD i niepewności. Poniższa tabela porządkuje te etapy i pokazuje, które kalkulatory najlepiej pasują do danego kroku.

Jeśli zadanie dotyczy twardości wody, jonów Ca²⁺ i Mg²⁺ albo miareczkowania EDTA, przejdź do kalkulatora kompleksometrii EDTA. Jeżeli zadanie bazuje na absorbancji i prawie Lamberta-Beera, dobrym punktem startu będzie kalkulator absorbancji, a potem dopiero krzywa kalibracyjna.

Krzywa kalibracyjna i regresja liniowa - wzory dla ucznia

Krzywa kalibracyjna jest podstawą wielu zadań z analizy ilościowej. Zamiast bezpośrednio ważyć analit w próbce, mierzymy sygnał, na przykład absorbancję, przewodność, powierzchnię piku albo intensywność sygnału. Następnie porównujemy ten sygnał z serią wzorców o znanych stężeniach. W najprostszym przypadku zależność jest liniowa i zapisuje się ją jako y = a · x + b, gdzie y oznacza sygnał, x oznacza stężenie, a jest nachyleniem prostej, a b jest wyrazem wolnym. Gdy znamy y próbki, możemy przekształcić wzór i obliczyć x = (y - b) / a.

Dla ucznia ważne są trzy rzeczy. Po pierwsze, nie wolno pomylić osi: na osi x zwykle leży stężenie wzorca, a na osi y sygnał. Po drugie, wyraz wolny b nie zawsze jest równy zero. Może wynikać z tła, blanku albo aparatury. Po trzecie, wysoki współczynnik R² nie oznacza jeszcze, że każdy wynik jest poprawny. R² mówi, jak dobrze punkty pasują do prostej, ale nie zastępuje oceny zakresu kalibracji, blanku, LOD, LOQ i jakości przygotowania wzorców.

Do obliczeń praktycznych użyj kalkulatora krzywej kalibracyjnej i regresji. Przy zadaniach z absorbancją możesz połączyć go z prawem Lamberta-Beera, bo wtedy uczysz się zarówno zależności A = ε · l · c, jak i praktycznej kalibracji z wielu wzorców.

LOD i LOQ - granica wykrywalności i granica oznaczalności

LOD mówi, od jakiego poziomu można uznać, że metoda widzi sygnał analitu ponad tłem. LOQ mówi, od jakiego poziomu można wynik sensownie oznaczać ilościowo. To rozróżnienie jest bardzo ważne, bo wynik „wykryto” nie zawsze oznacza, że można podać dokładne stężenie z taką samą pewnością jak dla próbki mieszczącej się wyraźnie powyżej LOQ. W materiałach spotyka się kilka procedur szacowania dolnych granic. W podejściu opartym na odchyleniu odpowiedzi i nachyleniu kalibracji często zapisuje się DL ≈ 3,3 · σ / S oraz QL ≈ 10 · σ / S. W innych przewodnikach można spotkać przybliżenie 3s albo odmienne podejście statystyczne, sygnał do szumu lub badanie próbek niskopoziomowych. Dlatego wzoru nie należy odrywać od instrukcji metody, liczby powtórzeń, rodzaju matrycy i przyjętego dokumentu walidacyjnego.

Jeżeli wynik próbki jest niższy niż LOD, zwykle zapisuje się go jako poniżej granicy wykrywalności. Jeżeli leży między LOD i LOQ, można mówić o wykryciu analitu, ale wynik ilościowy wymaga ostrożności. Jeżeli jest powyżej LOQ i mieści się w zakresie kalibracji, można przejść do dalszej oceny: odzysku, precyzji, niepewności i zgodności z wymaganiem. Uczniowie często mylą LOD z najmniejszym punktem kalibracyjnym. To nie zawsze to samo. Najniższy wzorzec jest punktem praktycznym, a LOD i LOQ wynikają z rozrzutu sygnału i czułości metody.

Obliczenia wykonasz w kalkulatorze LOD i LOQ. Jeśli w zadaniu podano od razu punkty wzorcowe, najpierw użyj kalkulatora krzywej kalibracyjnej, żeby uzyskać nachylenie.

Odzysk procentowy metody analitycznej

Odzysk procentowy odpowiada na pytanie, czy metoda potrafi odzyskać znaną ilość analitu z próbki. W najprostszym wariancie porównujemy wynik oznaczony z wartością dodaną albo z wartością odniesienia. Jeżeli do próbki dodano znaną ilość analitu, mówimy o próbie wzbogaconej, spike recovery albo matrix spike. Jeżeli porównujemy wynik z certyfikowanym materiałem odniesienia, często używa się skrótu CRM. Wzór zależy od układu zadania, ale idea jest jedna: wynik powinien być możliwie blisko wartości prawdziwej lub dodanej.

Dla ucznia najważniejsze jest rozróżnienie dwóch sytuacji. Gdy badamy próbę wzbogaconą, zwykle trzeba odjąć wynik próbki niewzbogaconej i dopiero tę różnicę porównać z ilością dodaną. Gdy badamy CRM, porównujemy wynik oznaczony z wartością certyfikowaną. Typowe zakresy akceptacji, na przykład 80-120% albo 90-110%, zależą od metody, poziomu stężenia i wymagań laboratorium. Wynik 100% oznacza idealny odzysk, ale w praktyce dopuszcza się odchylenia. Wynik zbyt niski może sugerować straty w przygotowaniu próbki, efekt matrycy albo niepełną ekstrakcję. Wynik zbyt wysoki może oznaczać interferencje, zły blank lub błąd kalibracji.

Do rachunków przejdź do kalkulatora odzysku procentowego metody analitycznej. Gdy wynik z odzysku jest poprawny, a seria nadal ma duży rozrzut, następnym krokiem powinna być analiza RSD i CV.

Niepewność pomiaru stężenia i zapis C ± U

Niepewność pomiaru stężenia pokazuje, jak szeroki jest rozsądny przedział wokół wyniku. W chemii analitycznej wynik bez niepewności bywa niepełny, bo sama liczba stężenia nie mówi, jak duży jest rozrzut pomiaru, wpływ kalibracji, pipetowania, rozcieńczenia, blanku albo przygotowania próbki. Najczęściej rozróżnia się niepewność standardową u(C) i niepewność rozszerzoną U. Jeżeli stosuje się współczynnik pokrycia k = 2, to U = 2 · u(C). Wynik raportuje się wtedy jako C ± U, na przykład 12,4 ± 0,8 mg/l.

Uczniowie często pytają, czy niepewność to to samo co błąd. Nie. Błąd porównuje wynik z wartością odniesienia, a niepewność opisuje przedział, w którym z określonym założeniem może znajdować się wartość wyniku. W zadaniach uproszczonych można spotkać składanie składowych przez pierwiastek z sumy kwadratów. Jeżeli mamy kilka niezależnych źródeł niepewności, nie dodajemy ich zwykle zwyczajnie, lecz liczymy niepewność złożoną. Dopiero potem przechodzimy do niepewności rozszerzonej. W praktyce ważne jest też zaokrąglenie: wynik i niepewność powinny mieć spójne miejsca dziesiętne.

Do liczenia użyj kalkulatora niepewności pomiaru stężenia. Jeżeli dopiero sprawdzasz powtarzalność serii wyników, wcześniej policz RSD i CV.

Precyzja, dokładność, RSD, CV i bias

Precyzja opisuje zgodność wyników między sobą, a dokładność opisuje zgodność wyniku z wartością odniesienia. To jedno z najważniejszych rozróżnień w chemii analitycznej. Seria może być bardzo precyzyjna, bo wyniki są blisko siebie, ale jednocześnie niedokładna, bo wszystkie są przesunięte względem wartości prawdziwej. Może być też odwrotnie: średnia wychodzi blisko wartości odniesienia, ale pojedyncze pomiary są bardzo rozrzucone. Dlatego w tabelach i sprawozdaniach obok średniej pojawia się odchylenie standardowe, RSD, CV, bias i błąd względny.

RSD, czyli relative standard deviation, oraz CV, czyli coefficient of variation, w praktyce oznaczają podobną ideę: względny rozrzut serii. Najczęściej liczy się je jako odchylenie standardowe podzielone przez średnią i pomnożone przez 100%. Im mniejsze RSD, tym lepsza powtarzalność serii. Bias pokazuje przesunięcie względem wartości odniesienia. Jeżeli wynik średni wynosi 10,4 mg/l, a wartość odniesienia 10,0 mg/l, bias wynosi +0,4 mg/l, a błąd względny +4%. W zadaniach trzeba pilnować, czy wymagany jest wynik bezwzględny, czy procentowy.

Serię pomiarów przeliczysz w kalkulatorze precyzji, dokładności, RSD i CV. Jeżeli RSD jest akceptowalne, a wynik ma być raportowany formalnie, kolejnym krokiem jest niepewność pomiaru stężenia.

Rozcieńczanie próbki, blank i współczynnik DF

Rozcieńczanie próbki jest jednym z tych etapów, które wyglądają prosto, ale bardzo często zmieniają końcowy wynik o rząd wielkości. Jeżeli pobierasz 5 ml próbki do kolby 50 ml, współczynnik rozcieńczenia DF wynosi 10. Jeżeli wynik z aparatu dotyczy roztworu po rozcieńczeniu, to stężenie w próbce pierwotnej jest zwykle wynikiem pomnożonym przez DF. Przy rozcieńczeniach seryjnych współczynniki się mnoży: rozcieńczenie 1:10, a potem 1:5 daje łączny DF = 50.

Blank, czyli próba ślepa, pozwala skorygować tło metody. Jeżeli sygnał blanku jest istotny, wynik próbki powinien być liczony z sygnału po odjęciu blanku. W zadaniach może to wyglądać tak: najpierw odczytaj sygnał próbki, odejmij sygnał blanku, przelicz wynik z krzywej kalibracyjnej, a potem uwzględnij rozcieńczenie. Pomylenie tej kolejności może dać fałszywy wynik. Uczniowie często mnożą przez DF sam sygnał, mimo że właściwe może być najpierw przeliczenie sygnału na stężenie, szczególnie gdy krzywa ma wyraz wolny inny niż zero.

Praktyczne rachunki są w kalkulatorze rozcieńczania próbki do analizy. Do klasycznego zadania C1V1 = C2V2 dla roztworów szkolnych pasuje też kalkulator rozcieńczania roztworów.

Kompleksometria EDTA i twardość wody w analizie

Kompleksometria EDTA to dobry przykład zadania, w którym chemia analityczna łączy miareczkowanie, stechiometrię i przeliczanie jednostek. EDTA tworzy kompleksy z jonami metali, a w oznaczaniu twardości wody najczęściej interesują nas jony wapnia i magnezu. W uproszczonych zadaniach przyjmuje się stosunek molowy 1:1 między EDTA a jonem metalu. Oznacza to, że liczba moli zużytego EDTA odpowiada liczbie moli oznaczanych jonów. Potem wynik często przelicza się na mg CaCO3/l, stopnie niemieckie °dH, stopnie francuskie °fH albo mmol/l.

Dla ucznia najtrudniejsze bywa to, że twardość wody nie zawsze jest podawana jako stężenie samego wapnia. Wyrażenie „mg CaCO3/l” jest umownym sposobem raportowania twardości jako równoważnika węglanu wapnia. Dlatego nie wystarczy odczytać objętości EDTA i wpisać jej jako stężenia. Trzeba przeliczyć mole EDTA, objętość próbki i jednostkę końcową. Jeżeli w zadaniu pojawia się blank, odejmujemy jego objętość od objętości zużytej na próbkę. Jeżeli próbka była rozcieńczana, wynik trzeba przeliczyć na próbkę pierwotną.

Do takiego typu zadań służy kalkulator kompleksometrii EDTA i twardości wody. Przy innych miareczkowaniach możesz przejść do kalkulatora miareczkowania kwas-zasada.

Najczęstsze typy zadań dla uczniów i studentów

W nauce chemii analitycznej warto rozpoznawać schemat zadania jeszcze przed liczeniem. Jeżeli w treści pojawiają się wzorce o znanych stężeniach i odpowiadające im sygnały, prawdopodobnie chodzi o krzywą kalibracyjną. Jeżeli pojawia się odchylenie standardowe blanku i nachylenie krzywej, najczęściej trzeba policzyć LOD lub LOQ. Jeżeli zadanie mówi o próbce wzbogaconej albo dodaniu znanej ilości analitu, szukaj wzoru na odzysk procentowy. Jeżeli widzisz serię pomiarów, średnią i odchylenie standardowe, prawdopodobnie potrzebne będzie RSD, CV albo niepewność.

Dobrym nawykiem jest zaznaczenie w treści zadania czterech informacji: co jest próbką pierwotną, co jest roztworem po rozcieńczeniu, co jest sygnałem, a co jest już stężeniem. Wiele błędów bierze się z traktowania każdej liczby jako wyniku końcowego. W sprawozdaniu laboratoryjnym warto dopisać krótką interpretację: czy wynik jest powyżej LOQ, czy mieści się w zakresie kalibracji, czy odzysk mieści się w wymaganym przedziale, czy RSD jest akceptowalne i czy wynik C ± U ma sensowną liczbę miejsc dziesiętnych. Taka interpretacja jest często ważniejsza niż sam rachunek, bo pokazuje, że rozumiesz znaczenie wyniku.

Najważniejsze wzory z chemii analitycznej w jednej tabeli

Poniższa tabela jest skrótem do szybkiej nauki przed sprawdzianem, kolokwium albo przygotowaniem sprawozdania. Nie zastępuje zrozumienia metody, ale pozwala szybko przypomnieć, który wzór pasuje do danego polecenia. Jeżeli w zadaniu pojawia się kilka etapów, użyj tabeli w kolejności od góry: najpierw przygotowanie próbki i blank, później kalibracja, potem ocena progu LOD/LOQ, a dopiero na końcu jakość wyniku.